بررسی قابلیت حیاتی تخمک های مراحل gvو mii منجمد- ذوب شده (انجماد شیشه ای) گوسـفند در شرایط آزمایشگاهی

هدف از انجام مطالعه حاضر بررسی اثر مرحله تکوینی، سلول های کومولوس، زمان های تعادلی مختلف و نسبت های متفاوت ازfcs در محلول انجمادی، روی توانایی تکاملی تخمک های نابالغ (gv) و بالغ (mii، همراه با سلول های کومولوس و بدون سلول های کومولوس) گوسفندی با استفاده از روش استرای تغییر یافته بود. علاوه بر آن اثر پیش تیمار تخمک ها با سیتوشالازینb (cb) نیز روی تکامل جنینی تخمک های منجمد- ذوب شده، بررسی شد. تخمدان های جمع آوری شده از کشتارگاه در نرمال سالین حاوی آنتی بیوتیک با دمای 35-30 درجه سانتی گراد طی 3-1 ساعت پس از جمع آوری به آزمایشگاه منتقل شدند. تخمک ها از فولیکول های با قطر mm6-2 به روش آسپیراسیون استحصال شده و در محیط تغییر یافتهhepes- tcm199 از پیش انکوبه شده (c60/38، 5% co2 و رطوبت 100%) جمع آوری گردیدند. تخمک های با سیتوپلاسم کاملاً گرانوله که حداقل سه لایه سلول کومولوس اطرافی داشتند (تخمک های با کیفیت خوب) انتخاب شدند. محیط پایه برای آماده سازی محلول های انجمادی، محیط بافری hepes- tcm199 دارای fcs بود. تخمک های انتخاب شده برای مدت زمان 5، 7 و یا10 دقیقه در محلول تعادلی حاوی 5/7% اتیلن گلیکول و 5/7% دی متیل سولفوکسید قرار گرفته و سپس به محلول انجمادی حاوی 15% اتیلن گلیکول، 15% دی متیل سولفوکسید و نیم مول ساکارز برای مدت زمان 30 ثانیه منتقل شدند. پس از آن تخمک ها روی نوک استرای تغییر یافته بارگیری شدند و محیط باقی مانده اطراف تخمک ها با استفاده از یک پیپت پاستور ظریف برداشته شد به طوری که حجم محیط باقی مانده کمتر از 1 میکرولیتر باشد. استرای بارگیری شده سریعاً به داخل نیترو‍ژن مایع فرو برده شد. بعد از ذوب در محلول حاوی 5/. مول ساکارزز، بقای تخمک، قابلیت تلقیح و تکامل بعدی جنینی ارزیابی شد. بعد از لقاح، تفاوتی در میزان بقا بین سه گروه مورد آزمایش (gv, miid, miicoc) مشاهده نشد و بیش از 66/. تخمک ها فرآیند انجماد- ذوب را تحمل کردند. تخمک هایmiicoc میزان بالاتری از تسهیم را در مقایسه با دو گروهgv وmiid (به ترتیب 04/0±53%، 03/0±37% و 05/0±41% ؛05/0p<) نشان دادند. اثر cb روی بقای تخمک های منجمد- ذوب شده معنی دار نبود، در حالی پیش تیمار تخمک ها باcb سبب اعمال تأثیرات منفی روی میزان تسهیم در تخمک های هر سه گروه (به ترتیب 04/0±20%، 05/0±13% و 09/0±17% در سه گروهgv، miid وmiicoc) در مقایسه با میزان آن در گروه کنترل (02/0±35%، 03/0±47% و 05/0±41% ؛ به ترتیب برای گروه هایgv، miid وmiicoc) شد. اثر زمان های تعادلی مختلف روی میزان بقا و تسهیم تخمک های منجمد- ذوب شده به جزء در میزان تسهیم تخمک های گروهmiid در زمان تعادلی 7 دقیقه (55%) در مقایسه با زمان تعادلی 5 دقیقه (34%)، معنی دار نبود. میزان تسهیم در تخمک های گروهmiicoc تحت تأثیر نسبت fcs در محلول انجمادی قرار گرفت (به ترتیب 53% و 40% ، در حضور 20% و 10%fcs ؛ 05/0p<). در نتیجه، توانایی تکاملی بعد ازانجماد تخمک های گوسفندی توسط حضور سلول های کومولوس و مرحله تکوینی تخمک و نسبتfcs در محلول انجمادی تحت تأثیر قرار می گیرد. علاوه برآن تیمار تخمک های گوسفندی با cb قبل از انجماد سبب اعمال اثرات منفی روی بقا و توانایی تکاملی بعدی تخمک می گردد. مطالعات بیشتری جهت افزایش توانایی تکاملی تخمک های گوسفندی بعد از انجماد لازم است.